Themenschwerpunkte des Naturkundemuseums sind zoologische, botanische und geologische Aspekte des Paderborner Landes. Die Lebensräume Wald, Heide, Feuchtgebiete, Landwirtschaftsflächen und Dorf- und Stadtbereiche werden mit Präparaten von jeweils typischen Lebewesen vorgestellt.
Die kleine geologische Abteilung im Obergeschoss befasst sich vor allem mit der Kreidezeit und der Eiszeit, weil diese Erdzeitalter die heimische Region besonders geprägt haben.
Es gibt im Museum viele Möglichkeiten, selbst aktiv zu werden, z.B. hört man auf Knopfdruck Stimmen verschiedener Tiere, einige Exponate dürfen angefasst werden, andere können mit Hilfe von Lupen oder Mikroskopen aus ganz ungewohnter Nähe betrachtet werden. Verborgenes hinter Klappen und Gucklöchern fördert ebenfalls die Neugier. Auch ein paar Aquarien und ein Beobachtungsbienenstock laden zum Entdecken ein.
Wechselnde Sonderausstellungen ergänzen zeitweise die Dauerausstellung.
Verschiedene Rallye-Bögen zum Erkunden des Museums sind kostenlos bei der Aufsicht erhältlich (teils auch in englischer und französischer Sprache). Sie können vorab im Internet angesehen werden (pdf-Dateien; download möglich). In der Regel gibt es auch zu jeder Sonderausstellung einen Rallye-Bogen.
Schreibunterlagen und Stifte können kostenlos bei der Aufsicht ausgeliehen werden.
Gruppen werden gebeten, ihren Besuch telefonisch anzukündigen.