Das mehrfach mit Preisen ausgezeichnete Dreiländermuseum ist das einzige Drei-Länder-Museum Europas. Es zeigt mit der Dreiländerausstellung in deutscher und französischer Sprache die zentrale Dauerausstellung zur Geschichte und Gegenwart der Drei-Länder-Region am Oberrhein. Welche Gemeinsamkeiten verbinden die Region? Wie entstanden hier drei Länder? Wie lebten die Menschen mit der Grenze im 20. Jahrhundert? Und wohin führt die Zukunft? Dabei werden viele Themen vorgestellt. Es geht um Grenzkontrollen, Schmuggel und um verschiedene Währungen, um die Sehnsucht nach Freiheit 1848, die Gewalt der Nationalsozialisten und den neuen Aufbruch nach dem Zweiten Weltkrieg.
Daneben präsentiert es jährlich mehrere große Sonderausstellungen. Als Mehrspartenhaus verfügt das Dreiländermuseum über eine der umfangreichsten Sammlungen in Südbaden.
Schwerpunkte sind die trinationale Geschichte und südbadische Kunst. Dazu gehören die größten öffentlichen Sammlungen mit Keramiken von Max Laeuger, zu Johann Peter Hebel oder zur badischen Revolution 1848/49.